1. 奧林巴斯顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整

　　為了使奧林巴斯顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明,在奧林巴斯顯微鏡初次安裝和調(diào)試時,就必須把照明光路系統(tǒng)調(diào)整好,這是正確使用奧林巴斯顯微鏡,并獲得正確、可*結(jié)果的重要手段和zui基本的要求.此外,正確掌握照明光路系統(tǒng)的調(diào)整,是使用奧林巴斯顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經(jīng)的步驟,也是在日常使用過程中不時地檢驗奧林巴斯顯微鏡性能的必要手段.奧林巴斯顯微鏡照明光路系統(tǒng)的調(diào)整主要有以下4項內(nèi)容:

　　(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調(diào)整

　?、?首先將燈室的外殼打開,壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中,安裝時避免手指直接接觸燈泡(可用柔軟的布或紙隔住),以免燈泡上留有指紋等臟物,影響燈泡的使用壽命.

　?、?把燈室擺在桌面上,接通電源后,用專用的螺絲刀調(diào)節(jié)燈的調(diào)焦旋鈕孔(標有"←→"),使燈絲投影在1-2m外的墻上,將燈絲成像調(diào)至清晰;然后調(diào)節(jié)燈的高低位置調(diào)節(jié)絲孔(標有"──"),使燈絲位置高低適當;再調(diào)節(jié)燈的左右位置調(diào)節(jié)螺絲孔(標有"──"),使燈絲左右位置合適.

　　(2) 光源發(fā)光體(燈絲)在奧林巴斯顯微鏡內(nèi)位置的檢驗和校正　目的是為了把發(fā)光體的像端端正正地調(diào)入物鏡的視域范圍內(nèi),從光源的角度去確保奧林巴斯顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明,這是調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的前提條件.需要的基本工具:對中望遠鏡購置奧林巴斯顯微鏡時已配備.

　?、?拔掉燈庫內(nèi)的毛玻璃套筒,把燈室裝回奧林巴斯顯微鏡上;

　　② 選用10×物鏡,開亮光源程序找樣品并調(diào)焦清晰,再換用40×物鏡把樣品調(diào)焦清 晰(40×物鏡可以看清燈絲的全貌);

　?、?把聚光鏡的孔徑光闌和視場光闌均開到zui大;

　?、?拔掉其中一個目鏡,換上對中望遠鏡,抓住白色部分,另一手伸縮黑色接目鏡,就可在視野中看到燈絲像;

　?、?如燈絲位置不合適,調(diào)"──"孔,把燈絲像沿水平方向調(diào)好,調(diào)"──"孔,把絲像沿垂直方向調(diào)好,直至將燈絲像調(diào)至剛好充滿物鏡孔徑的光圓像;

　?、?調(diào)整完畢后,將毛玻璃套筒插回原位,拔掉對中望遠鏡,換回目鏡作下一步調(diào)整.以上所述照明光源燈室在奧林巴斯顯微鏡外的調(diào)整和光源發(fā)光體在奧林巴斯顯微鏡內(nèi)位置的校驗,只需在奧林巴斯顯微鏡初次安裝調(diào)試及更換燈泡時進行,平時使用奧林巴斯顯微鏡時不能隨意亂調(diào)亂動.萬一調(diào)亂時,可按上述步驟調(diào)回原狀.

　　(3) 庫勒照明(Kohler)系統(tǒng)的正確調(diào)整　奧林巴斯顯微鏡的正確調(diào)試,主要工作之一是照明光路系統(tǒng)的調(diào)整,而其中的關(guān)鍵是庫勒照明系統(tǒng)的調(diào)整.對于每一位使用奧林巴斯顯微鏡的人員,特別是作顯微照像的人員來說,應(yīng)該對庫勒照明系統(tǒng)的原理及其調(diào)整步驟有一定的了解和掌握,才能充分發(fā)揮奧林巴斯顯微鏡應(yīng)有的功能,拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善.庫勒照明系統(tǒng)的原理簡單來說就是:光源發(fā)光體上任意一點發(fā)出的光,可以照明奧林巴斯顯微鏡的視域范圍,而光源發(fā)光體上每一點所發(fā)出的光匯集起來,在奧林巴斯顯微鏡的視域中就實現(xiàn)了非常充分而又均勻的照明.調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的目的,是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明,防止雜散光對照像系統(tǒng)造成影響或干擾,以免照像時在底片形成灰霧.高調(diào)整庫勒照明系統(tǒng)的必要部件:視場光闌、可進行合軸調(diào)整的聚光鏡系統(tǒng).

　?、?選用10×物鏡和10×目鏡;

　　② 把聚光鏡前端透鏡擺進光路中,孔徑光闌調(diào)至適中的位置上(不大不小),再把聚光鏡升到zui頂?shù)奈恢蒙?聚光鏡轉(zhuǎn)盤調(diào)至明視野"J"位置;

　?、?把視場光闌調(diào)至zui小(0.1);

　　④ 載物臺上放上已封片的生物樣品,開亮光源,調(diào)焦清晰;

　?、?視域中會出現(xiàn)一個局部照明的區(qū)域或亮斑,這是視場光闌的模糊像,在其中可以清晰地看到樣品的細節(jié);在它之外是較暗的視域,不一定能把樣品的細節(jié)看得清楚;

　　⑥ 把聚光鏡微微地向下調(diào),使視野中的亮斑逐漸收小,慢慢變成一個清晰的多邊形象,這便是視場光闌的清晰像;

　?、?一般情況下,多邊形象并不在視域中央,需要調(diào)整聚光鏡的一對調(diào)中螺絲,把視場光闌多邊形的像調(diào)至中央位置;

　?、?逐漸開大視場光闌,使多邊形象成為視域的內(nèi)接多邊形,進一步核對調(diào)中的狀況,如對中不夠理想,繼續(xù)微微調(diào)對中螺絲;

　?、?將視場光闌稍為再微微開大一些,使它的多邊形象恰好消失在視域的邊緣上,至此,庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整完畢.庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好以后,整個視域照明均勻,拍攝的顯微照片明亮清晰,反差正常.在日后使用過程中應(yīng)特別注意: a. 視場光闌不可任意開大,但可隨物鏡倍數(shù)的增大而將視場光闌收小,隨物鏡倍數(shù)的減小而開大; b. 聚光鏡的高低位置不準亂調(diào),否則會破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng); c. 使用10×以下物鏡時要將聚光鏡前端透鏡擺出光路外,使用10×或10×以上物鏡時要將前端透鏡擺入光路中; d. 關(guān)于物鏡倍數(shù)與視場光闌大小配合問題,在實際使用過程中,作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌,但作顯微照相時,為了避免雜散光線對照相系統(tǒng)的干擾,以便能拍攝到較完善的照片,則應(yīng)在使用每一個倍數(shù)的物鏡時,把視場光闌調(diào)節(jié)到正好消失于所觀察的視域邊上,這是比較繁復(fù)的工作,但又非做不可.較為簡便的方法是把與各個倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的視場光闌事先調(diào)整好,并作好記號,以后使用時根據(jù)記號直接調(diào)至相應(yīng)的位置.

　　(4) 孔徑光闌的正確使用　由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響奧林巴斯顯微鏡的分辨率,使用時應(yīng)掌握正確的使用方法.過去由于對孔徑光闌的認識不足,往往把它當作是調(diào)節(jié)視野亮度的工具.雖然調(diào)節(jié)孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度,但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率,在使用過程中應(yīng)盡可能避免.為了發(fā)揮聚光鏡孔徑光闌的作用,以便在觀察時,尤其在作顯微照相時獲得zui佳分辨率,在每換用一個倍數(shù)的物鏡時,在樣品調(diào)焦清晰后,需要調(diào)節(jié)孔徑光闌,使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑(物鏡孔徑像)的2/3 .調(diào)整方法是用對中望遠鏡對焦于視野中黑色相差環(huán)上,調(diào)節(jié)孔徑光闌,可以看到一個多邊形的孔徑光闌像,然后調(diào)到等于物鏡孔徑像的2 /3,即介于黑色相差環(huán)外與圓形視域內(nèi)之間.為方便起見,可把與各倍數(shù)物鏡相對應(yīng)的孔徑光闌預(yù)先調(diào)整好,并作好標記,以免每次使用都要重新調(diào)整.

　　2.奧林巴斯顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)概要

　　奧林巴斯顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整,是根據(jù)不同奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)的需要而進行的.所謂奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)(microscopy),概括而言就是以奧林巴斯顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法,以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法.以下簡述奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的奧林巴斯顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法.

　　(1) 透射光明視野(brightfield)　這是自奧林巴斯顯微鏡發(fā)明以來zui傳統(tǒng)、zui普遍的應(yīng)用方法.基本部件: a. 物鏡:任何物鏡都可作明視野觀察; b. 聚光鏡:各種聚光鏡均可,配有孔徑光闌.調(diào)整方法:在上述奧林巴斯顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后,即可應(yīng)用明視野法.

　　適用范圍:所有已染色的組織切片、血液涂片等. 注意事項: a. 使用明視野方法觀察時,一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好; b. 視場光闌不可任意開大,使用10×、10×以下和10×以上物鏡時,要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中; c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度,更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置,否則,會降低奧林巴斯顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng); d. 作顯微照相時,每換用一個倍數(shù)的物鏡,就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌,使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 .

　　(2) 透射光相差法(phase-contrast)　這是現(xiàn)代奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強法.基本部件:相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片.調(diào)整方法: a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上,用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰; b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對準轉(zhuǎn)盤刻度線位置,選用10×相差物鏡,換上待觀察的透明樣品; c. 拔掉其中一個目鏡,換上對中望遠鏡,并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上(物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)); d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合,調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置(調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕),使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合; e. 調(diào)整好后,換回觀察用目鏡,將綠色濾光片按入光路中,即可觀察到樣品的相差像; f. 有20×和40×物鏡觀察時,聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上,用100物鏡時,聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上.適用范圍:適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品,如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等.

　　(3) 微分干涉相襯法(differential interference-contrast,DIC)　為了克服相差法觀察時樣品細節(jié)像周圍伴隨有光暈,會掩沒掉本來應(yīng)該看見的細節(jié),以及樣品或組織切片厚度要求相當薄,原則上下能厚于10?m等局限性,利用雙光束干涉的原理設(shè)計子微分干涉相襯法.調(diào)整方法 a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法; b. 先用10×物鏡,以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置; c. 把起偏器(polarizer)擺入照明光路中,注意其取向應(yīng)為東—西方向; d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10×物鏡對應(yīng)使用的位置上,即DIC 0.3—0.4; e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片(DIC slider); f. 把檢偏器(analyser)插入成像光路中,注意其取向應(yīng)為南—北方; g. 換上待觀察的透明樣品,開亮光源把樣品調(diào)焦清晰; h. 調(diào)節(jié)DIC插片,使微分干涉相襯的像達到zui佳效果,也就是浮雕效果zui為明顯; i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌,使反差的效果也達到zui佳; j. 然后再細微調(diào)樣品的細節(jié),可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu); k. 如果把補色器(first order red retardation plate)插入,并同時調(diào)節(jié)DIC插片,可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩,紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有.適用范圍:透明或不能染色的組織切片,厚度可達100?m左右,培養(yǎng)中的活組織和活細胞、小生生物等.

　　(4) 落射光激發(fā)的熒光法(incident-loght fluorescence Epi-FL)　簡稱為落射熒光法,是近代奧林巴斯顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強有力的反差增強法.它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方,光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品,從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察.該方法較簡便,效率高,50W的光源強度比透射熒光法的250W還強.熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發(fā)樣品,只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分,它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光.不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光,而釋放的熒光也會有特定的波長,因而用作特異性的鑒定十分有效,如某些致病的細菌和螺旋體,受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光,很容易作出鑒定,這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法.某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光,或吸收后不能釋放熒光,但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料,而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光,再釋放出特定的熒光,從而間接地鑒別出某種物質(zhì),這稱為間接熒光法.上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、生物學及工業(yè)的特異性研究和鑒別上.調(diào)整方法:熒光奧林巴斯顯微鏡或附有熒光部件的奧林巴斯顯微鏡,調(diào)整的方法大致相同.

　?、?汞燈的安裝 a. 打開包裝,取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上,安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面,汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(cè)或右側(cè);

　　b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上,再把汞燈的下電極及上電極引線另一端,分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定; c. 鎖緊散熱片上的螺絲后,把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中,鎖緊相應(yīng)的螺絲,再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上. d. 詳細的安裝方法請參照有關(guān)說明書.

　?、?汞燈燈室在奧林巴斯顯微鏡外的初步調(diào)整: a. 接通汞燈電源,讓汞燈預(yù)熱10-15min; b. 把汞燈燈室擺放在桌面上,讓汞弧投影到2-3m外的墻上,劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線; c. 轉(zhuǎn)動燈室調(diào)焦旋鈕,使汞弧的像清晰地投影于墻上; d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔,把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量*近,但不要重疊在一起.

　?、?汞燈汞弧在奧林巴斯顯微鏡內(nèi)位置的檢驗: a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到zui大; b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上,以避免汞燈中的藍光太刺眼; c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上,蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙; d. 取下一個物鏡,使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上,白紙上會有一藍色的圓形照明區(qū)域,汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位,否則,可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至zui清晰,然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔,直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置. e. 調(diào)好之后,把物鏡裝回去,通過目鏡可見白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光; f. 仔細調(diào)焦,可看清白紙的纖維;取去白紙,樣品上的熒光細節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰.

　　④ 汞燈使用注意事項　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈,燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞(室溫下附在管壁上),未點燃時,管內(nèi)氣壓很低,在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點燃后,汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光,溫度升高,管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓.由于是高氣壓的氣體放電,必須了解其特性才能安全地使用汞燈. a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時間,汞才能充分汽化并形成汞弧,產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光.因此,觀察前要提早通電; b. 汞燈在使用過程中,不要隨意開關(guān)汞燈的電源; c. 關(guān)掉汞燈電源后,必須等待15-20min,待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源,違反這一操作規(guī)定時,將會造成嚴重后果!由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化,汞蒸氣內(nèi)阻很小,一旦通電在兩電極間施加電壓,汞燈內(nèi)形成強大的電流,輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈,重則汞燈爆炸,汞蒸氣彌漫整個實驗室,造成工作人員中毒,不僅損失了汞燈,還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件. d. 汞燈的使用壽命一般只有300h,使用得當可達600h,使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比,應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察.汞燈價格及昂貴,應(yīng)珍惜使用. e. 汞燈壽命終結(jié)的標志是點燃困難,燈管發(fā)黑.

　　(5)暗視野法(dark field)

　　許多透明或半透明的樣品,如細菌、微生物、細胞內(nèi)的精細結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等,在明視野奧林巴斯顯微鏡中不容易看清楚,如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度.以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細節(jié).普遍光學奧林巴斯顯微鏡的zui高分辨率為0.2?m,而暗視野奧林巴斯顯微鏡雖然對樣品的細節(jié)構(gòu)造分辨不清楚,但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在,即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu),特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等.

調(diào)整方法:暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡.使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好.換上暗視野聚光鏡時,要把載玻片(樣品)移開,將浸沒油滴在聚光鏡頂部,再把樣品載玻片擱在物臺上,浸沒油便充填在兩者之間,這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用.另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用,這種聚光鏡具有中央光擋,照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進入聚光鏡內(nèi).對于配備齊全的相差奧林巴斯顯微鏡,與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán),可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果.